摘要：雞胚絨毛膜尿囊膜血管試驗 (chorioallantoic membrane vascularassay，CAMVA)和雞胚絨毛膜尿囊膜試驗 (heg’s egg test-chorioallantoicmembrane，HET-CAM)已被證實為有效的體外替代方法[1]。本文采用了雞胚絨毛膜尿囊膜血管試驗(CAMVA試驗) 和雞胚絨毛膜尿囊膜試驗 (HET-CAM試驗) 通過控制濃度對市售兩款常見洗面奶的眼刺激性進行研究，再結(jié)合家兔法（Draize 試驗）進行驗證。結(jié)果表明：用改進CAMVA試驗在濃度為3%，與雞胚尿囊膜接觸20min來表示洗面奶的眼刺激性更為合適。
對于比較幾個樣品之間的刺激性，選用雞胚尿囊膜試驗還是比較有優(yōu)勢的；雞胚絨毛膜毛尿囊膜結(jié)構(gòu)與眼結(jié)膜相似，通過觀察受試物對血管的作用評價潛在的眼刺激性，具有較高的敏感性[2]，而且也符合3R原則。對于檢測中度以下的眼刺激性效果較好，尤其是能有效區(qū)分無刺激性物質(zhì)[3]，但對輕度刺激性以上的物質(zhì)無法精確區(qū)分。
1.試驗材料、儀器
SPF 級白萊杭雞受精雞胚，購于新興大華農(nóng)禽蛋有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證: SCXK( 粵) 2018-0019。受試樣品為2種市售洗面奶：韓束優(yōu)悅舒妍溫和潔顏泡、芙麗芳絲凈潤洗顏泡沫。其它材料：全自動孵化箱，電子記時器，聚四氟乙烯環(huán)，體式顯微鏡，相機，照蛋器等。
2.試驗方法
2.1 CAMVA試驗
受精雞胚置于微電腦全自動孵化機孵育，于第4天在雞胚窄端鉆一小孔，抽取約2 mL蛋清。在雞胚位置的上方開約2 cm2的窗口，用透明膠帶封住。隨后放入恒溫恒濕箱繼續(xù)孵育。第10天，從孵化箱中取出雞胚，去掉薄膜，用眼科鑷擴大窗口，暴露血管膜不受損。將聚四氟乙烯樹脂環(huán)置于每只雞胚的 CAM 上，加入樣品。在體式顯微鏡下觀察聚四氟乙烯樹脂環(huán)內(nèi)與環(huán)外的血管損傷情況，根據(jù)表1對結(jié)果進行評分，得分≥1的為陽性結(jié)果。用Bliss 法計算半數(shù)反應(yīng)濃度(RC50)，即引起一半雞胚出現(xiàn)陽性反應(yīng)的受試物濃度。如果樣品的RC50＞3%，認(rèn)為無刺激性；1%＜RC50＜3%，無法判定是否有刺激性；RC50＜3%，認(rèn)為有刺激性。
2.2 改進CAMVA試驗在CAMVA試驗的基礎(chǔ)上，再結(jié)合原有評分標(biāo)準(zhǔn)，浙江省食品藥品檢驗研究院何立成[4]改良了 CAMVA試驗，通過計算加權(quán)平均數(shù)來確定受試樣品的刺激程度，具體分類見表 2。
n i 為該組對應(yīng)評分(i)的雞胚個數(shù)，n為該組雞胚總數(shù)。
2.3 HET-CAM試驗
根據(jù)《SN/T2329-2009》化妝品眼刺激性腐蝕性的雞胚絨毛尿囊膜試驗[4]方法進行測試。取9日齡雞胚，剝?nèi)馐椅恢玫牡皻げ糠郑┞栋咨澳?，加適量生理鹽水濕潤蛋殼膜，剝?nèi)サ皻つ?，暴露出尿囊膜。根?jù)受試物的是否透明，HET-CAM分為刺激評分法和終點評分法兩種評分法。
2.3.1 刺激評分法（irritayion score, IS）
刺激評分法適用于透明受試物。取受試液體0.3mL直接滴加于CAM表面，觀察CAM反應(yīng)情況，并記錄作用5min內(nèi)每種毒性效應(yīng)出現(xiàn)的時間。計算得到刺激評分（irritayion score,IS）
式中：sec H、secL、sec C、分別為CAM 膜上開始觀察到開始發(fā)生出血、血管溶解、出現(xiàn)凝血的平均時間，單位為秒（s）。
2.3.2 終點評分法（end point score, ES）
終點評分法適用于不透明的液體受試物。取0.3g受試樣品均勻涂布于塑料薄膜表面成薄層，再將其覆蓋于CAM上。作用3min后，用生理鹽水沖洗CAM 膜上的受試物后，觀察每種效應(yīng)變化的程度。
ES＝6只雞胚得分的數(shù)學(xué)總和。根據(jù)ES數(shù)值按上述評分對受試物眼刺激性進行分類。
2.4 Draize兔眼試驗
根據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版 急性眼刺激性/腐蝕性試驗方法進行。將0.1ml受試物直接涂入新西蘭兔一側(cè)眼睛的眼結(jié)膜中，30s后用足量、流速較快但又不會引起動物眼損傷的水流沖洗30s,另一側(cè)眼睛不處理作為自身對照。在涂入受試物后1h、24h、48h和72h對新西蘭兔眼睛進行檢查及記錄積分。
3.結(jié)果與討論
3.1 CAMVA 試驗
用CAMVA實驗測試了2個洗面奶的RC50數(shù)據(jù)見下表
3.2 改進CAMVA試驗
何立成[4]研究發(fā)現(xiàn)，改進CAMVA試驗測試3%濃度的洗面奶，接觸時間為20 min，體內(nèi)外試驗結(jié)果一致性為90%。我們用改進CAMVA試驗試驗了1%和3%兩個不同濃度的洗面奶，評價結(jié)果見表7。
3.3 HET-CAM試驗
用HET-CAM試驗檢測了2款洗面奶的刺激性。利用終點評分法，數(shù)據(jù)見表8。同時用反應(yīng)時間法分別測試測試了2款洗面奶（1%和3%）的刺激性，結(jié)果見表9。
表8表明，2個洗面奶的原液刺激性都是強刺激性，數(shù)據(jù)之間差別也較小。這是因為雞胚試驗對于輕度刺激性以上的物質(zhì)無法精確區(qū)分[6]。用雞胚尿囊膜試驗法測洗面奶原液的刺激性并不合適。
表9結(jié)果顯示，當(dāng)濃度稀釋至1%時，用反應(yīng)時間法，2款洗面奶都是無刺激性。當(dāng)濃度稀釋為3%時，有1個洗面奶樣品為輕刺激性，另1個洗面奶樣品為中度刺激性。此結(jié)果與上面改進CAMVA結(jié)果相比較，在1%時刺激性結(jié)果基本相符：在濃度為3%時兩種測試結(jié)果的刺激性并不相符，還需再進一步研究。
3.4 Draize兔眼試驗
該試驗數(shù)據(jù)由廣東省?；瘷z測中心提供。結(jié)果見表10
根據(jù)兔眼試驗的結(jié)果，洗面奶1和洗面奶2的結(jié)果與改進CAMVA在3%時的結(jié)果一致；由于家兔法有一段恢復(fù)時間，而CAMVA 法沒有，可能會導(dǎo)致后者的刺激性評級高于前者[2]。
4.實驗結(jié)論
(1)通過改進CAMVA、HET-CAM、Draize兔眼試驗3種方法測試洗面奶刺激性，結(jié)果表明Draize兔眼試驗對刺激性并不敏感，最敏感的HET-CAM，改進CAMVA處于中間；Draize兔眼試驗結(jié)果無刺激，并不是對人體眼睛不刺激。
(2) 用改進CAMVA試驗評價洗面奶的眼刺激性時，采取濃度為3%，接觸時間為20min時得到的結(jié)果與Draize兔眼試驗結(jié)果相同，也與CAMVA的測得的RC50數(shù)據(jù)相符。
5. 參考文獻
[1]陳麗珍,金淑芳,潘育方.化妝品眼刺激性試驗替代方法的研究進展[J].廣東化工,2016,43(21):81-83+91.
[2]Bagley DM，Cerven D，Harbell J．Assessment of thechorioallantoicmembrane vascular assay ( CAMVA ) in theCOLIPA in vitro eye irritationvalidation study［J］．ToxicolInVitro，1999，13(2) : 285 － 293．
[3]DanielMB，Perveen YＲ，Betty MK，et al． Evaluation of the
vascular components of the chorioallantoic membraneassay as a
model for eye irritation potential: II ［J］． Cutan Ocular Toxicol，
1991，10( 1 － 2) :105 － 113．
[4]何立成，等.雞胚絨毛膜尿囊膜血管試驗法用于評價化妝品眼刺激性的可行性研究[J]中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2017，34（8）:1158-1162。
[5]國家質(zhì)檢監(jiān)督檢驗檢疫總局.化妝品眼刺激性腐蝕性的雞胚絨毛尿囊膜試驗(SN/T2329-2009) [S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.
[6].秦瑤，等.整合CAMVA和BCOP方法檢測化妝品的眼刺激性[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2014,24(6):79-81.
6. 聲明
(1)為了不影響商家的利益，受試物（洗面奶1、洗面奶2）與2個品牌的洗面奶（韓束優(yōu)悅舒妍溫和潔顏泡、芙麗芳絲凈潤洗顏泡沫）對應(yīng)關(guān)系特別隱去。
(2)本研究只對樣品和研究過程負(fù)責(zé)。
